神马作文网淀粉酶比活力测定如何在生化实验室测定淀粉酶的比活力?（注明：是比活力）
来源：学生作业帮 编辑：神马作文网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/10 12:52:16
淀粉酶比活力测定
如何在生化实验室测定淀粉酶的比活力?（注明：是比活力）
如何在生化实验室测定淀粉酶的比活力?（注明：是比活力）
谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定
几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强.主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶.种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长.α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化.本实验以萌发种子为材料,测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异.
【原理】
两种淀粉酶具有不同理化特性,α-淀粉酶不耐酸,在PH3?6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热,在70℃下15Min则被钝化.据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出β-淀粉酶活力.淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸.在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力.
【仪器与用具】
分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支,刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支.
【试剂】
麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100Ml.
DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20Ml 12Mol／L NAOH溶液中,加入50Ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100Ml.盖紧瓶塞,勿使CO2进入.若溶液混浊,可过滤后使用.
1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液：A液(0?1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21?01g,用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0?1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29?41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀,即为0?1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液.
1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液中.
【方法】
1.酶液提取称取25℃下萌发3～4天的小麦种子1?0g(芽长1?5CM),置研钵中,加少量石英砂和2Ml蒸馏水,研磨成匀浆后转入离心管中,用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管,提取液在室温下放置提取15～20Min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取.然后在3000r／Min转速下离心10Min,将上清液倒入50Ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液.吸取上述淀粉酶原液5Ml,放入50Ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液.
麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表18-1加入试剂：
表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表
试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml)2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg)00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml)2222222摇匀,置沸水浴中煮沸5Min.取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20Ml.以1号管作为空白调零点,在540nM波长下比色测定.以麦芽糖含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.
酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表18-2进行操作.
表18-2酶活力的测定配方表
操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min,取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（ml)000111DNS试剂（ml)2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液（ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂（ml)02.02.002.02.0摇匀,置沸水浴中5Min,取出后冷却,加蒸馏水至20Ml,摇匀,在540nM波长下比色,记录测定结果.
结果计算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg),再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα),淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／g·Min)表示：
Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg),按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT?
AT＝CT×VTFW×t×V1
式中A:淀粉酶活性,Aα为α-淀粉酶的活性,AT为淀粉酶总活性,主要是α、β-淀粉酶的活性；
Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值,以下同)；
CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；
V1:显色所用酶液体积(Ml)；
T:酶作用时间(Min)；
VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml,α＋β淀粉酶为500Ml)；
FW:样品鲜重(g).
【思考题】
1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异?这种变化有何生物学意义?
实验中设置对照的意义何在?
α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同?作用特点有何不同
几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强.主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶.种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长.α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化.本实验以萌发种子为材料,测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异.
【原理】
两种淀粉酶具有不同理化特性,α-淀粉酶不耐酸,在PH3?6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热,在70℃下15Min则被钝化.据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出β-淀粉酶活力.淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸.在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力.
【仪器与用具】
分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支,刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支.
【试剂】
麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100Ml.
DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20Ml 12Mol／L NAOH溶液中,加入50Ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100Ml.盖紧瓶塞,勿使CO2进入.若溶液混浊,可过滤后使用.
1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液：A液(0?1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21?01g,用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0?1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29?41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀,即为0?1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液.
1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 1Mol／L PH5?6的柠檬酸缓冲液中.
【方法】
1.酶液提取称取25℃下萌发3～4天的小麦种子1?0g(芽长1?5CM),置研钵中,加少量石英砂和2Ml蒸馏水,研磨成匀浆后转入离心管中,用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管,提取液在室温下放置提取15～20Min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取.然后在3000r／Min转速下离心10Min,将上清液倒入50Ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液.吸取上述淀粉酶原液5Ml,放入50Ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液.
麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表18-1加入试剂：
表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表
试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml)2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg)00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml)2222222摇匀,置沸水浴中煮沸5Min.取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20Ml.以1号管作为空白调零点,在540nM波长下比色测定.以麦芽糖含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.
酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表18-2进行操作.
表18-2酶活力的测定配方表
操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min,取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（ml)000111DNS试剂（ml)2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液（ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂（ml)02.02.002.02.0摇匀,置沸水浴中5Min,取出后冷却,加蒸馏水至20Ml,摇匀,在540nM波长下比色,记录测定结果.
结果计算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg),再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα),淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／g·Min)表示：
Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg),按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT?
AT＝CT×VTFW×t×V1
式中A:淀粉酶活性,Aα为α-淀粉酶的活性,AT为淀粉酶总活性,主要是α、β-淀粉酶的活性；
Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值,以下同)；
CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；
V1:显色所用酶液体积(Ml)；
T:酶作用时间(Min)；
VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml,α＋β淀粉酶为500Ml)；
FW:样品鲜重(g).
【思考题】
1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异?这种变化有何生物学意义?
实验中设置对照的意义何在?
α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同?作用特点有何不同