荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办
来源:学生作业帮 编辑:神马作文网作业帮 分类:数学作业 时间:2024/09/23 10:30:34
荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办
做荧光定量标准曲线,同时做内参β-actin和自己的基因SA,结果内参相关系数为1.000,扩增效率为99.7%,SA相关系数为0.990,扩增效率为137.3%,初始模板浓度为2,按-4倍稀释,得怎么改条件,
做荧光定量标准曲线,同时做内参β-actin和自己的基因SA,结果内参相关系数为1.000,扩增效率为99.7%,SA相关系数为0.990,扩增效率为137.3%,初始模板浓度为2,按-4倍稀释,得怎么改条件,
1、调整下体系,不要自己配置反应液,最好用商品的MIX,这样各个组分都是最佳的配比.
2、三步法改为两步法,退火延伸设置为一步,大部分的温度为60度,这个只是建议,具体看你买的试剂的说明书,会有具体的说明.
3、很有可能有非特异性扩增,自己排查下反应体系,根据溶解曲线是否单峰,扩增曲线CT值综合分析.
再问: 谢谢,溶解曲线是单峰,反应液是SyBR,ROX、cDNA,引物,体系没得改了,退火延伸设为一步的意思是把温度都设为60吗?时间是多少,还需要考虑自身引物的退火温度吗
再答: 不同公司的酶其时间是不一样的,一般为30s至1分钟,一切看产品说明书。建议再做一次,如果还是相同的情况就直接给试剂公司的客服打电话。
2、三步法改为两步法,退火延伸设置为一步,大部分的温度为60度,这个只是建议,具体看你买的试剂的说明书,会有具体的说明.
3、很有可能有非特异性扩增,自己排查下反应体系,根据溶解曲线是否单峰,扩增曲线CT值综合分析.
再问: 谢谢,溶解曲线是单峰,反应液是SyBR,ROX、cDNA,引物,体系没得改了,退火延伸设为一步的意思是把温度都设为60吗?时间是多少,还需要考虑自身引物的退火温度吗
再答: 不同公司的酶其时间是不一样的,一般为30s至1分钟,一切看产品说明书。建议再做一次,如果还是相同的情况就直接给试剂公司的客服打电话。
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