引物设计出现问题,目的片段扩增不出来,原因是?

设计的方法跟你说的差不多,之所以使用软件,是可以同果软件计算你一对引物的Tm值,GC含量,以及两个引物之间是否会形成二聚体,这样你就可以通过分析结果来调整你两条引物的长度使上下游的引物扩增效率更高

这样就P不出来的啊要换模板的必须要比目的基因要长再问：谢谢。只能重新设计了。

如果只想做序列的克隆,那么引物往两端延伸没问题.如果要做蛋白表达的话起始端必须是起始密码子.引物不可以在起始密码子之前,否则影响表达起始.扩不出来的话,首先分析一下序列,是否GC含量较高.然后尝试一下

第二次比如目的基因是300bps,母链DNA2000bpsforwardprimer从母链第25碱基开始由5'-3'开始复制,backwardprimer从第325由3'-5'开始反向复制.第一次复制

引物本来就是单链的.书上画成双链才怪.PCR所用的DNA聚合酶只能顺着已经存在的一小段DNA的尾巴来接着合成,它不会自己起头.引物就是这么一小段用来起头的DNA.DNA本身很长很长,我们扩增时,只能扩

引物的功能是作为核苷酸聚合的起始点,引导DNA的合成.能设定循环次数,及控制复制次数.PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度.一般的循环次数选在30～40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之

当然可以咯,不过我没明白为什么上游引物GCrich跟分两段扩增有什么关系,1.2K一次扩增是完全没有问题的,如果上游引物出现GCrich的情况,那么可以考虑在更加上游的地方设计引物啊,在这个基因外测的

1.首先这应该是个融合表达载体.应该考虑后面的读码框问题.就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基.使得你的目的基因和egfp在同一读码框内.2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后

没有必要纠结于这些概念目的基因,就是你要研究的那个基因.除非你要克隆基因全长,不然RT-PCR就是用来扩增一小段（所谓目的基因片段）再问：我想做rt-pcr但是我找了好长时间也没有找到：狗β3-ar引

用primerblast,输进去上下游,选好种属和扩增对象search不就出来了

若是根据已知序列扩增未知物种的相应序列,可以根据先根据已知序列进行Blast搜索,发现其他同源序列,保存后进行比对,找出其中较保守区域,并根据Primer或Oligo等软件对某条序列进行分析,搜索其中

基本不是.当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题.如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段.有些重复片段的扩增,GC含量高的

cDNA和mRNA的序列是互补的,如果用两个引物,最后的两条DNA序列分别对应于mRNA和cDNA中的一段.由于引物方向从5‘至3’,所以两个引物对应于mRNA和cDNA中相应序列即可.

如果这两个引物特异性很好,扩出来的不是非特异性片段,那么大小应该是一样的,只不过若有等位基因存在的话,会出现个别碱基缺失,也就是会有几b的差异.

一般对于已知序列的PCR当然不要从保守序列来设计引物,只要从开放可读框前后开始设计就行了.需要从保守序列设计引物的情况一般是两种,一是某个物种里面某个特定基因序列从未被分离过,但其进化关系相近的物种有

引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基.短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合,但是它们的专一性不够.较长的引物能提高专一性,然而退火效率低,从而导致PCR产量低下.同时应避免编码单一序列和

PCR产物测序的最大风险是有在凝胶上看起来的一个条带,实际上有多个分子.也就是说长度相似的分子有可能在电泳的时候只有一条带.如果只是进行PCR产物回收,没有进行凝胶分离的过程的话,东西可能更多了.问题

你的引物怎么这么长?预变性94℃5min,变性45s,退火温度看你引物是怎么设计的了.你这么长的引物估计退火温度肯定是60℃以上了.退火45s即可.72℃延伸1.5min到2min.（pfu聚合速度大

我不了解你的实际情况,我给你几条建议：1.可能是内参引物有问题2.你扩增内参基因的PCR条件设计可能有问题,如Tm3.你用的是一块胶吗?加核酸染料了吗?

“同一对引物可以扩增出不同基因；不同引物也可以扩增出相同基因?”“在基因诊断时,比如镰状细胞贫血是点突变,患者和正常人在突变点两侧的基因是一样的”　　这里混淆了基因和基因序列的概念.患者和正常人的基因