如何构建和筛选基因工程细胞

如何构建和筛选基因工程细胞

我们常常说基因是生物体进行生命活动的“蓝图”,这是因为生物体可以通过基因的特异性表达,来完成各种生命活动.例如,青霉菌能够产生出对人类有用的抗生素——青霉素；豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮；家蚕能够吐出丝……那么,人们能不能通过改造生物体的基因,定向地改变生物的遗传特性呢?比如,通过对基因进行改造和重新组合,让禾本科的植物也能够固定空气中的氮,让细菌“吐出”蚕丝,让微生物生产出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物.科学家们经过多年的努力,终于在20世纪70年代,创立了一种能够定向改造生物的新技术——基因工程.那么,什么是基因工程呢?基因工程又是怎样改变生物遗传特性的呢?
一 基因工程的基本内容
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术.这种技术是在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”,对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞内进行无性繁殖,使重组基因在受体细胞内表达,产生出人类所需要的基因产物.通俗地说,就是按照人们的主观意愿,把一种生物的个别基因复制出来,加以修饰改造,然后放到另一种生物的细胞里,定向地改造生物的遗传性状.
基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的.DNA分子的直径只有2.0nm(粗细只有头发丝的十万分之一),其长度也是极其短小的.如流感嗜血杆菌的DNA,长度只有0.83?m,即使是较大的大肠杆菌,其长度也只有1.36?m.要在如此微小的DNA分子上进行剪切和拼接,是一项非常精细的工作,必须要有专门的工具.
基因操作的工具
用什么样的工具才能准确无误地对基因进行剪切和拼接呢?这是从事基因工程研究的科学家首先遇到的难题.例如,通过基因工程培育抗虫棉时,就需要将抗虫的基因从某种生物(如苏云金芽孢杆菌)中提取出来,“放入”棉的细胞中,与棉细胞中的DNA结合起来,在棉中发挥作用.这里遇到的难题主要有两个：首先是苏云金芽孢杆菌的一个DNA分子有许多基因,怎样从它的DNA分子的长链上辨别出所需要的基因,并且把它切割下来.其次是如何将切割下来的抗虫基因与棉的DNA“缝合”起来.为了突破这些难关,科学家进行了许多试验,最后他们发现了一种“基因剪刀”和“基因针线”,可以用来完成基因的剪切和拼接.
基因的剪刀——限制性内切酶 基因的剪刀指的是DNA限制性内切酶(以下简称限制酶).限制酶主要存在于微生物中.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子(如图).例如,从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列,并在G和A之间将这段序列切开.目前已经发现了二百多种限制酶,它们的切点各不相同.苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因,就能被某种限制酶切割下来.
基因的针线——DNA连接酶 从图中可以看出,被限制酶切开的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对,这样的切口叫做黏性末端.可以设想,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割,然后让两者的黏性末端黏合起来,似乎就可以合成重组的DNA分子了.但是,实际上仅仅这样做是不够的,互补的碱基处虽然连接起来,但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的踏板连接起来,两边的扶手的断口处还没有连接起来(如图).要把扶手的断口处连接起来,也就是把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来,还要靠另一种极其重要的工具——DNA连接酶.
基因的运输工具——运载体 要将一个外源基因,如上面所说的抗虫基因,送入受体细胞,如棉细胞,还需要有运输工具,这就是运载体.作为运载体的物质必须具备以下条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接；具有某些标记基因,便于进行筛选.目前,符合上述条件并经常使用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等.
质粒是基因工程最常用的运载体,它广泛地存在于细菌中,是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子,大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一(如图).质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中.一般来说,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用.但是,质粒的复制则只能在宿主细胞内完成.
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒.因为土壤农杆菌很容易感染植物细胞,所以科学家培育转基因植物时,常常用土壤农杆菌中的质粒做运载体.
基因操作的基本步骤
进行基因操作一般要经历四个基本步骤,也就是基因操作的“四步曲”.
提取目的基因 基因操作的第一步,是取得人们所需要的特定基因,也就是目的基因(如图).如前
面提到的苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因,还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、
种子的贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等,都是目的基因.
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因,犹如大海捞针,是十分不易的.科学家们经过不懈地探索,想出了许多办法,概括地说,主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因.
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,又叫“散弹射击法”.这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟,无论哪一颗弹粒击中目标,都能把鸟打下来.鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增),从中找出含有目的基因的细胞,再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来.如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得.
用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大,具有一定的盲目胜.又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段,不能直接用于基因的扩增和表达,因此,在获取真核细胞中的目的基因时,一般是用人工合成基因的方法.
目前人工合成基因的方法主要有两条途径.一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的基因.另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学的方法,以单核苷酸为原料合成目的基因(如图).如人的血红蛋白基因、胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得.
20世纪80年代以后,随着DNA核苷酸序列分析技术的发展,人们已经可以通过DNA序列自动测序仪(见本章题图左上照片)对提取出来的基因进行核苷酸序列分析,并且通过一种扩增DNA的新技术(也叫PCR技术),使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增.上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术.
目的基因与运载体结合 将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程.如果以质粒作为运载体,首先要用一定的限制酶切割质粒,使质粒出现一个切口,露出黏性末端.然后用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端.将切下的目的基因的片段插入到质粒的切口处,再加入适量的DNA连接酶,质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合,形成了一个重组DNA分子(如图).如人的胰岛素基因就是通过这种方式与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合,形成重组DNA分子(也叫重组质粒)的.
将目的基因导入受体细胞 目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后,下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增(如图).
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等.
用人工的方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞,主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径.例如,如果运载体是质粒,受体细胞是细菌,一般是将细菌用氯化钙处理,以增大细菌细胞壁的通透性,使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞.目的基因导入受体细胞后,就可以随着受体细胞的繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能够获得大量的目的基因.
目的基因的检测和表达 以上步骤完成以后,在全部受体细胞中,真正能够摄入重组DNA 分子的受体细胞是很少的.因此,必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测.检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因.
重组的DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达过程.例如,科学家最初做抗虫棉试验时,虽然已经检测出棉的植株中含有抗虫的基因,但让棉铃虫食用棉的叶片时,棉铃虫并没有被杀死,这说明抗虫基因还不能在高等植物中表达.科学家在研究的基础上,又一次对棉植株中的抗虫基因进行了修饰,然后再让棉铃虫食用棉的叶片,结果食用的第二天棉铃虫就中毒死亡了.这说明抗虫基因在棉植株中得到了表达