请问有设么关于质粒构建、引物设计的文献可以看吗

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引物设计的原则
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配).
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度（primer length）,产物长度 （product length）,序列Tm 值(melting temperature),引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用∆G 值反映),形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值,在错配位点（false priming site）的引发效率,引物及产物的 GC 含量（composition）,等等.必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等.根据有关参考资料和笔者在实践中的总结,引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延 伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2].
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导 致错配.引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增 加[2].
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响.不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4].另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败.5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物[2].
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5].
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳.Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest
neighbor method) [6][7].
6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性.应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9）,而5’端和中间∆G 值相对较高的引物.引物的3’端的∆G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6].
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8].
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定.
值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一.有的模板本身条件比较困难,例如GC
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含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产 物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低.在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条 件.
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能,该功能只有少数 商业版软件能够做到,其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能,各种软件在 这方面的侧重点不同,因此自动搜索的结果也不尽相同.据笔者的经验,自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用,“Oligo 6”其次,其他软件如“ector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能,但搜索结果不是十分理想.
要想得到效果很好的引物,在自动搜索的基础上还要辅以人工分析.笔者认为引物设计软件 的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用,以“Premier”进行自动搜索,“Oligo” 进行分析评价,如此可快速设计出成功率很高的引物.
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计( )、
限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( ).“Premier”还具有同源
性分析功能（ ）,但并非其特长,在此略过.此外,该软件还有一些特殊功能,其中
最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、
语音提示键盘输入（ ）等等.
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸（20 种常见 结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会 遇到部分碱基的不确定性.这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物.遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的.“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列.软件共给出八种生物亚结 构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒 体（Inertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（ertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）.
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）.限制性酶切点分析及基元查找功 能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列,-35 序列 等）,按确定即可.常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到.你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶或基元.
进行引物设计时,点击按钮,界面如下：
进一步点击按钮,出现“search criteria”窗口,有多种参数可以调整.搜索目
的（Seach For）有三种选项,PCR 引物（PCR Primers）,测序引物（Sequencing Primers）,杂交探针（Hybridization Probes）.搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer,或Both）,或者成对查找（Pairs）,或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）.另外还可改变选择区域（Search Ranges）,引物长度（Primer Length）,选择方式（Search Mode）,参数选择（Search Parameters）
等等.使用者可根据自己的需要设定各项参数.如果没有特殊要求,建议使用默认设置.然 后按,随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时,再按, 这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物（Sense）,下游引物 (Anti-sense),成对显示(Pairs).默认显示为成对方式,并按优劣次序（Rating）排列,满分 为100,即各指标基本都能达标（如下图）.
点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“Peimer Premier”
主窗口,如图所示：
该图分三部分,最上面是图示PCR 模板及产物位置,中间是所选的上下游引物的一些
5 性质,最下面是四种重要指标的分析,包括发夹结构（Hairpin）,二聚体（Dimer）,错误引 发情况（False Priming）,及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）.当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时,按钮由变成,点击该按钮,在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况.一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最 好的情况是最下面的分析栏没有,只有.值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度,可参考应用.
在需要对引物进行修饰编辑时,如在5’端加入酶切位点,可点击,然后修改引物序列.若要回到搜索结果中,则点击按钮.
如果要设计简并引物,只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则,反推至DNA 序列即可.对简并引物的分析不需像一般引物那样严格.
总之,“Premier”有优秀的引物自动搜索功能,同时可进行部分指标的分析,而且容易
使用,是一个相当不错的软件.
Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的.它的使用并不十分复杂,但初学者容
易被其复杂的图表吓倒.Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo .22 的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq 图.“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计.但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界.
2. 使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq,其中Frq 是6.22 版本的新功能,为邻近6
至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率.该频率高则可增加错误引发6的可能性.因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade 排列方式不太方便,可从windows菜单改为tili 方式.如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo 5.0,只是显示更清楚了.
经过Windows/Tili 项后的显示如图：
在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm 图块上左 下角的Upper 按钮,选好上游引物,此时该按钮变成,表示上游引物已选 取好.下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower.∆G 值反映了序列与模板的结
合强度,最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低（如图：）
Tm 值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应.Frq 曲线 为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小.选取引物时,宜选用3’端Frq 值相对较低的片段.
当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改.首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性.需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）.二聚体形成的能值 越高,越不符合要求.一般的检测（非克隆）性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物.第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好.一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5 为好. 当然,在设计克隆目的的PCR 引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构, 而且能值不会太低.这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高.第三项检查为GC 含量,以45-55％为宜.有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近,以有利于退火温度的选择.如果PCR 的模板不是基 因组DNA,而是一个特定模板序列,那么最好还进行False priming site 的检测.这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性.如果引物在错配位点的引发效率比较 高,就可能出假阳性的PCR 结果.一般在错配引发效率以不超过100 为好,但对于特定的7
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模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率.如果两者相差很大,比如在正确位点的 引发效率为450 以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物也是可以接受的.
当我们结束以上四项检测,按Alt+P 键弹出PCR 窗口,其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm 值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价.
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似,并且似乎并
不比后者更好用,在此不再赘述.其实,使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物,如果参数设置得当将大大提高工作效率.