用琼脂糖凝胶电泳分析核酸（DNA和RNA）有哪些影响因素?

用琼脂糖凝胶电泳分析核酸（DNA和RNA）有哪些影响因素?

核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因而带负电荷,电泳时向正极迁移.琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子,使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的.琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速,通过调整其使用浓度,使得分辨率达到大多数实验的要求,因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法.但操作过程中仍有不少要注意的问题.
1 凝胶制作
1．1 凝胶浓度 配制凝胶的浓度据实验需要而变 ,一般在0．8％ 2．0％之间,如果一次配制凝胶100 ml,没用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加,水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定,补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量.粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值.以保证凝胶浓度基本维持在原浓度.核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中,终浓度为0．5 t*g／ml；也可在电泳结束后染色.
1、2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板,梳齿宽厚,形成的点样孑L容积较大,用于DNA 片段回收实验等；相反,梳齿窄而薄,形成的点样孑L容积就较小,用于PCR产物、酶切产物鉴定等.梳板的选择主要是看上样量的多少而定,一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果分析.另外,每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孑L底层,导致点样后样品渗漏.当然,点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孑L.
2 点样
点样需加上样缓冲液,因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度,使样品沉入孑L底；指示样品的迁移过程,上样缓冲液中一般加了两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂,DNA染色剂是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光).上样缓冲液储存液一般为6× (10×),表示其浓度为工作浓度的六倍.使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度.点样方法是将移液器基本垂直点样孑L,用另一只手帮助固定移液器下端,移液器枪头(Tip)尖端进入点样孑L即可将样品注入孑L内,千万不可将Tip尖插至孑L底,并点上适合的DNA分子量标准,所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内.
3 电泳
将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连,负极与负极相连,核酸带负电荷,从负极向正极移动.电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好,电泳缓冲液太多则电流加大,凝胶发热.电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v／cm(指的是正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度),电泳时间一般为3O～60 min,根据实验需要也可作适当调整,电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰；相反,电压降低,电泳时间较长,核酸条带整齐清晰.另外,如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动,请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉.
4 结果分析
较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰,样品条带也整齐清晰,如果条带模糊暗淡,单从琼脂糖凝胶电泳角度来说,可能的原因：溴化乙锭的质和量怎样?溴化乙锭见光易分解,母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效),或者终浓度没达到0．5 vg／ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多,缓冲能力下降.特别是TAE缓冲液,一般用2～3次就要更换,TBE缓冲液则可使用10次左右.
实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清,那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过2 0％ ,较小的核酸片段在它的分辨范围之内,并且EB带正电荷,电泳时会向负傲移动,如果将凝胶置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min,较小的片段则可重新染色：另外,溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂,操作过程中要戴手套,并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存