,第一次做荧光定量PCR,内参基因可以跑出来,但是荧光峰度比较低,溶解曲线也不错,但目的基因完全跑不出

来源：学生作业帮编辑：神马作文网作业帮分类：语文作业时间：2024/11/11 13:24:49

,第一次做荧光定量PCR,内参基因可以跑出来,但是荧光峰度比较低,溶解曲线也不错,但目的基因完全跑不出
目的基因在普通PCR仪上,可以跑出来,跑电泳条带清晰,引物二聚体不明显.但是在realtime-pcr上没有扩增的荧光曲线.而且溶解曲线没有明显的峰.模板浓度从10倍稀释,5倍稀释,到2倍稀释都做了,内参基因都可以,不错荧光峰度都较低,目的基因一直没有扩增的荧光曲线....

朋友,首先跟你说一下我的经验,其实这里有个误区,其实普通PCR对Realtime PCR的指导意义实在是太小,因为realtime PCR的引物跟普通PCR的引物有很大差别,realtime PCR的引物因为要顾及试验体系的要求,所以在引物性能方面有一些牺牲,比如有时候要求180-200bp的扩增需要会牺牲一些性能,比如存在二聚体之类的东西.溶解曲线没有明显的峰说明没有扩增产物,这里面问题很多,比如温度条件、引物条件等等,最好还是能够找公司帮你设计引物,比如takara等公司,可以帮你设计引物.再有一个问题,你说你的模板稀释倍数越来越小依然没有产物,你觉得困扰,其实并不是像你想的那样,按照你的思路,你扩增产物应该是丰度比较低的产物,这样的扩增反应你认为模板量越大越好,其实不然,因为反转录buffer和realtime buffer是不同的,而且反转录体系的一些组分能够抑制realtime反应的进行,因此,可能你稀释倍数越低,最后反而realtime反应的扩增效率越低,你可以尝试把稀释倍数高一些试试看,因为当时我在做实验的时候确实在丁香园上看到有的战友提到过这样的问题,如果再有问题我们可以再讨论,大家一起提高,希望能帮到你.
再问：大谢！回答很有帮助。。我今天用师兄的模板做了一次标准曲线。 1、内参基因在28-30 cycle达到阈值，但是荧光值很低，目的基因跑出来了几条，但只有一个样品在39个cycle时候有达到阈值，其他的并没有达到阈值，产物跑电泳发现有条带。请问这个可以理解为我的目的基因在组织中表达量就是特别低么？希望能指点一下我，实验室没有人做这个，连讨论的人都没有，谢谢啦

,第一次做荧光定量PCR,内参基因可以跑出来,但是荧光峰度比较低,溶解曲线也不错,但目的基因完全跑不出第一次做荧光定量PCR,内参基因能够跑出来,而且溶解曲线也比较好,但是目的基因完全跑不出来荧光定量pcr扩得出目的基因但是检测不到内参gapdh 不同阶段的荧光定量实验都需要做目的基因及内参基因的标准曲线吗我现在要做荧光定量PCR,有3个目的基因,以ACTIN基因作为内参,分析其在根茎、根、茎、叶的表达情况, 请教做染料法荧光定量PCR,熔解曲线分析,如何区分目的基因产物和引物二聚体呢? 请问我在做荧光定量pcr的时候内参的ct值很低大约在35左右,而目的基因ct值在25左右请问荧光定量PCR进行相对定量时,若是目的基因和内参基因扩增效率不一致,为什么会导致结果的不准确? 关于金银花荧光定量试验中的内参基因选择问题! 我要做荧光定量PCR,测细胞因子mRNA,要测三种因子,是否是把三种引物和内参基因引物分别加入到四个体系中还想再向您请教下关于荧光定量PCR 相对定量内参基因的选择,如果我想用18SrRNA,我该怎么得到这个内参呢实时荧光定量pcr内参是什么东西