神马作文网怎样提取叶中的dna怎样提曲植物中的dna
来源：学生作业帮 编辑：神马作文网作业帮 分类：综合作业 时间：2024/11/18 14:58:41
怎样提取叶中的dna
怎样提曲植物中的dna
怎样提曲植物中的dna
1、取3g小麦叶片,加入液氮充分研磨后移至10ml离心管
2、在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite(sigma,S-9000),充分混匀,调节pH至8.0
3、在样品离心管中加入3ml提取液,用玻璃棒混匀
4、65℃水浴30min左右,期间可上下颠倒几次
5、冷却至室温后,加入约3ml氯仿、异戊醇（24：1）用力摇匀至充分乳化,放置在摇床上摇动15min左右
6、8000rpm离心6min(或者4000rpm离心30min)
7、倒出或吸取上清液,转移至一新离心管中,如有杂质,可用干净灭菌纱布过滤.加入体积约为上清液2倍的冰无水乙醇（这里为6ml）,-20℃放置1h(如过夜效果更佳)
8、挑出DNA,并转入到10ml离心管中,如果勾出DNA有困难,可以低速离心使其沉淀.加入适量70%酒精,摇动洗涤10min,重复洗涤2-3次
9、冷冻干燥机中干燥DNA,加入适量TE(2ml左右)在65℃溶解,溶解过程中可每隔30min轻微涡旋一次,知道DNA完全溶解.溶解后,3000rpm离心2min,再将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管,4℃或-20℃保存.DNA可直接用于Southern或PCR等操作
如需纯化,则进行下一步
10、将上述DNA溶液转移至10ml离心管中,加入3mlTE增大体积
11、加入10ulRNase(10mg/ml),室温处理0.5-1.0小时
12、加入等体积氯仿、异戊醇混匀,12000rpm离心5min
13、取上清转入新的离心管中,加入1、10体积的3mol/L NaOAc和2倍体积的冰无水乙醇,-20℃放置1小时或过夜
相当于先在酒精中加入1、20体积的3mol/L NaOAc,约1.23g
14、勾出DNA置于1.5ml Eppendorf管中,冷冻干燥后加入适量TE,65℃溶解,4℃或-20℃保存
DNA提取液pH8.0:
1mol/L Tris-HCl pH8.0 100mL 缓冲液调节pH
0.5mol/L EDTANa2 100ml 螯合镁离子
5mol/L NaCl 100ml 沉淀DNA
20%SDS 62ml 破坏细胞膜
ddH2O 638ml
0.5mol/L EDTA(500ml)
EDTANa2 93.05g
ddH2O 400ml
NaOH 8g
混匀,充分溶解后调pH至8.0
1mol/L Tris-HCl(1000ml)
Tris碱 121.1g
ddH2O 800ml
浓HCl 49ml
混匀,充分溶解后调pH至8.0,定溶至1000ml
TE(1000ml)
1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10ml
0.5mol/L EDTANa2(pH 8.0) 2ml
加入ddH2O到1000ml,混匀,调pH至8.0,定溶至1000ml
2、在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite(sigma,S-9000),充分混匀,调节pH至8.0
3、在样品离心管中加入3ml提取液,用玻璃棒混匀
4、65℃水浴30min左右,期间可上下颠倒几次
5、冷却至室温后,加入约3ml氯仿、异戊醇（24：1）用力摇匀至充分乳化,放置在摇床上摇动15min左右
6、8000rpm离心6min(或者4000rpm离心30min)
7、倒出或吸取上清液,转移至一新离心管中,如有杂质,可用干净灭菌纱布过滤.加入体积约为上清液2倍的冰无水乙醇（这里为6ml）,-20℃放置1h(如过夜效果更佳)
8、挑出DNA,并转入到10ml离心管中,如果勾出DNA有困难,可以低速离心使其沉淀.加入适量70%酒精,摇动洗涤10min,重复洗涤2-3次
9、冷冻干燥机中干燥DNA,加入适量TE(2ml左右)在65℃溶解,溶解过程中可每隔30min轻微涡旋一次,知道DNA完全溶解.溶解后,3000rpm离心2min,再将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管,4℃或-20℃保存.DNA可直接用于Southern或PCR等操作
如需纯化,则进行下一步
10、将上述DNA溶液转移至10ml离心管中,加入3mlTE增大体积
11、加入10ulRNase(10mg/ml),室温处理0.5-1.0小时
12、加入等体积氯仿、异戊醇混匀,12000rpm离心5min
13、取上清转入新的离心管中,加入1、10体积的3mol/L NaOAc和2倍体积的冰无水乙醇,-20℃放置1小时或过夜
相当于先在酒精中加入1、20体积的3mol/L NaOAc,约1.23g
14、勾出DNA置于1.5ml Eppendorf管中,冷冻干燥后加入适量TE,65℃溶解,4℃或-20℃保存
DNA提取液pH8.0:
1mol/L Tris-HCl pH8.0 100mL 缓冲液调节pH
0.5mol/L EDTANa2 100ml 螯合镁离子
5mol/L NaCl 100ml 沉淀DNA
20%SDS 62ml 破坏细胞膜
ddH2O 638ml
0.5mol/L EDTA(500ml)
EDTANa2 93.05g
ddH2O 400ml
NaOH 8g
混匀,充分溶解后调pH至8.0
1mol/L Tris-HCl(1000ml)
Tris碱 121.1g
ddH2O 800ml
浓HCl 49ml
混匀,充分溶解后调pH至8.0,定溶至1000ml
TE(1000ml)
1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10ml
0.5mol/L EDTANa2(pH 8.0) 2ml
加入ddH2O到1000ml,混匀,调pH至8.0,定溶至1000ml