PCR中突变构建三个末尾一样的融合基因,其它两个都顺利的构建完成了,测序也正确.问题就出在第三个上,已经完全重新PCR三

PCR中突变
构建三个末尾一样的融合基因,其它两个都顺利的构建完成了,测序也正确.问题就出在第三个上,已经完全重新PCR三次并构建测序,尾部引物地方总是有突变,而且突变的位点也不完全一致,谁能指教一下.
我的一些考虑
1.如果说是引物有问题的话,那么前两个构建的测序正确.（因此不能说引物有问题）
2.如果说使用的酶等有问题的话我在构建的时候已经全部更换了材料.
3.如果说测序有问题的话,同样一份样品我送了两家不同的测序公司测序,但两分报告一样.

污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染.
(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性.
还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.
污染的监测
一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染.
对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳 性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照.
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染.
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
防止污染的方法
一． 污染的预防
进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现.
（一）划分操作区：目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
1.标本处理区,包括扩增摸板的制备；
2.PCR扩增区,包括反应液的配制和PCR扩增；
3.产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备.
各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性.如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理.
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区.
（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装.所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：
1． PCR用水应为高压的双蒸水；
2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；
3． 引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因.
(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一.因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套；
2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染；
3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底.若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度；
5.最后加入反应模板,加入后盖紧反应管；
6.操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性；
7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器.如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8.重复实验,验证结果,慎下结论.