怎么用甘油保存菌,还有提DNA的溶菌酶要过夜可以吗?溶菌酶与土样作用多久效果好?

怎么用甘油保存菌,还有提DNA的溶菌酶要过夜可以吗?溶菌酶与土样作用多久效果好?

用甘油保存菌实际上就是保证菌液中含有15%左右的甘油就OK了,主要是为了防止在冷冻过程中细胞内形成冰晶损伤细胞.具体做法的话,你可以先配置30%的甘油溶液,然后灭菌.再与你的菌液1比1混合后,就可以放到－70度冰箱保存了.记住,一般不要把保存管装太满,三分之一到一半左右就行了.至于DNA的提取,我不知道你是提什么物种的DNA,如果是细菌其实绝大部分情况下是可以不用溶菌酶的,我们实验室是直接用SDS+蛋白酶K裂解的,37度孵育1个小时就OK了.
再问： 恩谢谢你的方法，我看过文献都是那样的方法，不过我用其他的方法了。 至于DNA我现在都提不出来，提的是土壤总DNA,现在，是盐含量比较高的样。提完后有结晶呢。愁死了。
再答： 土壤总DNA我没有提取过，不过如果是含盐高的话，你可以试试沉淀后用70%的乙醇多洗涤几次，70%的乙醇不溶解DNA，但30%的水可以溶解掉盐成份。当然如果你确定那个结晶是盐的话。当然，这个只适用于你要确定你沉淀中含有DNA，如果没有DNA也是白搭。然后，土壤总DNA提取量估计也不会很大，所以最后沉淀应该是看不到的，用乙醇洗涤的时候小心别把DNA给倒掉，最后溶解后你要确定有没有的话，给你的建议是：1琼脂糖凝胶电泳，2分光光度计检测A260nm和A280nm，3PCR扩增细菌16s真菌的ITS啊等等序列。
再问： 我洗了三次。感觉像是盐，因为用水溶解DNA时他就会融掉的，一般来说，若果再提完DNA后用无水乙醇和NaAC沉淀应该会看到小气泡是吗？我的可以看到的。而且还有很多，我现在用16s扩增后条带特别亮，可是我就是害怕做后续试验时会对结果有影响。所以我比较着急，没办法往下做。
再答： 纯净的核酸是没有颜色的，但由于密度问题如果量大可以因为一些折射的缘故显示出略带白色的透明丝状沉淀物质，虽然看起来像蛋白，但判断的一个简单标准是看它是否黏壁，纯净的核酸是黏壁的，还有就是它是不是易溶于水，蛋白是难溶的而核酸易溶。当然这种情况只限于原始生物材料非常大的情况，比如植物与动物组织的DNA提取，这些往往都是0.1g左右的原始材料。如果是土壤样的话，总生物量是远远达不到植物或者动物组织DNA提取的量的，甚至达不到单一微生物富集培养物提取DNA的生物量，而一般单一微生物富集培养物提取DNA最后沉淀时都是啥都看不到的。所以，正常情况下你应该是什么都看不到的。16s能够扩增出来，至少就证明对PCR没有影响，如果你要做PCR，就直接拿这个做。如果你要构建宏基因组文库，你最好要确定是否对你的内切酶有影响，先做下预实验。还有啊，你提取的基因组DNA都没有进行过琼脂糖电泳检测么，虽然包含了很多不同物种的DNA，但由于琼脂糖凝胶只能分辨20kb以下的片段，大于20kb的片段都只会集中在20kb，而基因组DNA都是大于这个数的，所以你电泳的话应该只会看到一条带，DNA提取后最好还是电泳检测下好。16s扩增很亮，里面肯定是有DNA的，我不知道你对DNA浓度怎么要求的，如果不要求浓度很大，那么你可以试试沉淀后用400ul左右水溶解，然后加入0.6体积的异丙醇－20度再沉淀，当然具体沉淀时间要做预实验看DNA回收效率。如果怕效率低，可以沉淀过夜。后面的步骤同一般沉淀后洗涤是一样的，如果还有盐沉淀，就再重复一次。然后啊，注意一点是反复沉淀多少都会造成DNA损失，你必须要预实验来看回收效率确定最好回收时间。
再问： 恩 又涨了不少知识啊，谢谢您。我明天，不是，应该是今天准备割胶回收，看结果怎么样，到时有问题再向您请教可以吗？我不建宏基因组文库，就只是建克隆文库。
再答： 没问题，有问题你可以继续问我。