神马作文网有没有试剂盒在平头DNA末端加上一个T?
来源：学生作业帮 编辑：神马作文网作业帮 分类：综合作业 时间：2024/11/11 08:06:51
有没有试剂盒在平头DNA末端加上一个T?
加A多见,加T是为什么?能说详细点不?
PCR加T反应.如果回收后用50ul体系做加T反应:
10*PCR Buffer 5 ul
Mg2+ 3ul
TAQ(5U/ul) 2.5ul
dTTP(100mM) 1ul
平头DNA产物 38.5ul
------------------------------------------------------------
Total 50ul
70度水浴2小时.
但这样会在DNA两端都加上T,同时,多一个T,会不会给你的序列带来移码?
再问： 我要做基因组测序，这是我实验中的其中的一个步骤，为什么会使序列造成移码呢？我不是很明白呀 看来你是高手啊，我还有一个问题，DNA末端平滑化是什么意思？普通的taq酶扩增出来的PCR产物的3‘和5’末端是什么样的？扩增后的产物能够直接进行TA克隆吗？我会追加悬赏的...嘿嘿
再答： 高手谈不上，只是分子实验的基本操作。 我开始以为你要连接2个DNA片段，所以要考虑移码的问题。 有时基因组测序会用物理方法把DNA大片段打断，所以用T4 DNA 聚合酶把将5'端突出末端补平，也可以将3'端突出末端削平，也就是将粘性末端转化为平末端，就是末端平滑化。对酶切的粘性末端也可以这么处理。 一般的taq酶（不是所有的DNA聚合酶），都具有3’端加A活性，普通taq酶会在两个3’端都加一个突出的A，5’端没影响，可以直接连到T载体。但注意普通taq保真性较差，测序是没问题，做克隆就要小心突变问题。
再问： 我QQ1416659369。但是合成的引物一般5‘端都是OH啊，所以PCR产物没有5’磷酸基，不是吗？
再答： 一般的引物貌似5‘是羟基，这不会影响大部分的实验。 你如果需要5’磷酸化，可用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，不过要加点钱。
PCR加T反应.如果回收后用50ul体系做加T反应:
10*PCR Buffer 5 ul
Mg2+ 3ul
TAQ(5U/ul) 2.5ul
dTTP(100mM) 1ul
平头DNA产物 38.5ul
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Total 50ul
70度水浴2小时.
但这样会在DNA两端都加上T,同时,多一个T,会不会给你的序列带来移码?
再问： 我要做基因组测序，这是我实验中的其中的一个步骤，为什么会使序列造成移码呢？我不是很明白呀 看来你是高手啊，我还有一个问题，DNA末端平滑化是什么意思？普通的taq酶扩增出来的PCR产物的3‘和5’末端是什么样的？扩增后的产物能够直接进行TA克隆吗？我会追加悬赏的...嘿嘿
再答： 高手谈不上，只是分子实验的基本操作。 我开始以为你要连接2个DNA片段，所以要考虑移码的问题。 有时基因组测序会用物理方法把DNA大片段打断，所以用T4 DNA 聚合酶把将5'端突出末端补平，也可以将3'端突出末端削平，也就是将粘性末端转化为平末端，就是末端平滑化。对酶切的粘性末端也可以这么处理。 一般的taq酶（不是所有的DNA聚合酶），都具有3’端加A活性，普通taq酶会在两个3’端都加一个突出的A，5’端没影响，可以直接连到T载体。但注意普通taq保真性较差，测序是没问题，做克隆就要小心突变问题。
再问： 我QQ1416659369。但是合成的引物一般5‘端都是OH啊，所以PCR产物没有5’磷酸基，不是吗？
再答： 一般的引物貌似5‘是羟基，这不会影响大部分的实验。 你如果需要5’磷酸化，可用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，不过要加点钱。
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