重组质粒转化大肠杆菌,几乎全是假阳性.

来源：学生作业帮编辑：神马作文网作业帮分类：生物作业时间：2024/09/30 10:22:11

重组质粒转化大肠杆菌,几乎全是假阳性.
挑了26个菌做菌落PCR只有3个阳性克隆.为什么假阳性那么多呢?
会不会是感受态在-70度放得时间长了,不好用了.
还是没有酶切好?用的是BamH I和Hind Ⅲ限制酶,先在30度切了一个小时,又在37度切了一个小时,酶切用的是40微升体系,连接用的是1.5mL Ep管.连接用的是7 微升体系,连接体系中没加ddH2O.

质粒没切开啦
再问：但是跟上次用的同样的酶切条件啊。上次挑取10个菌做菌落PCR，其中6个阳性，结果还行。用的是BamH I和Hind Ⅲ限制酶，先在30度切了一个小时，又在37度切了一个小时，这样酶切效果不好吗？
再答：为啥要这么切那两个酶有星号活性的不在37°会乱切的好不好
再问：我用的是takara的限制酶，说明书上说BamH I的最适温度是30度，在37度不稳定。而Hind 的最适温度是37度。而且我也查了一些资料，有这样切的啊
再答：那你就分开切别一起切而且本来就是有阳性就可以了不用那么在乎效率啊
再问：因为我要构建突变库，需要很多很多的阳性。所以重组率越高越好。分开切的话，损失太大。
再答：那就买NEB的酶呗没办法这两个都有星号活性必须在最适温度切

怎样鉴定大肠杆菌质粒转化后获得的菌落是否为阳性? 将目的基因导入大肠杆菌,有可能重组质粒进入大肠杆菌但未与大肠杆菌质粒结合么? 从大肠杆菌中分离出来的质粒,经过Dna重组后,只能导入大肠杆菌中么? 将重组质粒导入大肠杆菌,先用氯化钙溶液处理大肠杆菌和细胞壁有关? 重组质粒已成功转入大肠杆菌内,-20°冻存,怎样复活,扩大培养? 用氯化钙法将质粒DNA转入大肠杆菌实验中,转化成功的关键有哪些? 科学家运用基因工程技术将人的胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达.如图所示a处为胰岛大肠杆菌制备感受态细胞和重组子转化实验中,没有实验结果质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞再热激以后进行活化培养,这时培养基为什么不加入抗生素请问用PCR克隆已知基因的步骤中为何要将回收的目的基因重组在大肠杆菌质粒上去呢? 转化后的重组子进行PCR,扩增出来的是目的基因还是整个质粒?为什么DNA测序是在转化后才进行? 为什么从土壤农杆菌中提取的质粒变为重组DNA分子后导入大肠杆菌,还要用标记基因筛选含目的基因的大肠杆菌,它原先不就有吗