转化后PCR无条带把连接产物连接到T载体之后转化大肠杆菌,用连接产物片段上有而T载体上没有的Kana抗性进行筛选,有转化

来源：学生作业帮编辑：神马作文网作业帮分类：语文作业时间：2024/10/04 19:32:58

转化后PCR无条带
把连接产物连接到T载体之后转化大肠杆菌,用连接产物片段上有而T载体上没有的Kana抗性进行筛选,有转化子长出.培养转化子后PCR,却扩增不出目的条带（即之前的连接产物,约3kb）.这是为什么?百思不得其解啊…

按照你的意思,插入序列是抗卡那霉素的基因,不知道我的理解是否正确.插入的序列应该表达量很小,所以不能作为筛选的标准,你的T载体原本是带什么抗性的?通常是Amp的,建议你用Amp来筛选
再问：但是如果用T-vector上面的Amp抗性筛选的话，岂不是会有很多假阳性？之所以用插入序列上的Kana抗性来筛选，就是为了避免假阳性。结果有了转化子，却扩增不出应有大小的条带.....不知道是为什么......
再答：你插入的序列没用凝胶回收试剂盒纯化一下吗？纯化过的片段再连接90%是真阳性，我认为i卡那霉素抗性基因是没法表达的，离启动子太远了

我构建的穿梭载体,连接好后进行双酶切和PCR两个途径的检测,结果酶切没有条带显示,而PCR确有目的条带! 菌液PCR不同条带将已扩增出来的993bp的cDNA与T载体连接,之后DH5α转化,涂平板,挑克隆!菌液PCR为何一组检如果将PCR扩增的X基因片段与克隆载体连接,并转化入宿主大肠杆菌中,写出技术路线（包括基因和载体的连接、转化和鉴定）和关构建载体的时候,先用设计好的引物PCR所要的目的基因,再和T载体连接,再转化,再小抽,再双酶切,再和连接到T载体上面后,做双酶切,条带不正确,目的片段变大是什么原因关于克隆的问题.假如我有有一个基因片段,未知序列.我可以把它连接到T载体,然后PCR 为什么我的目的基因连接克隆载体转化、提质粒后,酶切鉴定正确,而质粒PCR和菌液PCR鉴定都不正确呢?着急载体与插入片段连接好后进入宿主细胞转化这个时候已经有了一次转化为什么到后面又要转化呢? 基因工程里基因表达载体的构建这一步会得到多种连接产物,是否要进行筛选? 如果PCR产物可以直接用来测序,但为什么还需要买PCR产物纯化试剂盒,还要进行连接转化提质粒酶切? 菌落PCR有关问题?我们做了转化实验,将转化后的菌涂在含Kan抗性的平板上,为什么挑取能生长的菌落做PCR没有目的条带? 目的基因片段与载体DNA连接的主要有?