神马作文网小提质粒酶切出来了,为什么大提之后就切不出来了呢?
来源：学生作业帮 编辑：神马作文网作业帮 分类：综合作业 时间：2024/09/30 14:20:35
小提质粒酶切出来了,为什么大提之后就切不出来了呢?
主要是你在大提时,一次放大的倍数太大,导致细菌丢失质粒的比例过多,质粒提取的质与量明显下降,杂质太多,所以就切不出来,你可以试着将DNA加入量减少,看一下能否行的通.如本来加入500ng/10ul反应体系的,加入250ng/10ul试一下.
再问： 什么是DNA量假如减少呢？是在酶切的时候吗？我质粒是手提的，酶切时加入质粒的量为40微升
再答： 质粒的量并不是以微升算的，它是质量或者摩尔来计算的，质量是ug,mg或者ng，摩尔的单位是mol或者mmol，我们一般说的质粒浓度是指的ng/ul，我说的加量减少，就是降低酶切反应中，质粒DNA的浓度。你说的加入40ul，这是个非常不科学的说法，你的反应体系是多少，质粒浓度是多少，条件非常模糊，这样的问题是没办法解答的，你需要自己清楚这方面的数据。我们一般的酶切体系中的质粒DNA浓度是50ng/ul，给你做个参考。
再问： 谢谢您的回答，我是初学者，就按照实验室以前的套路做，我们在提质粒的最后一步加20微升左右的含有RNase的TE，准备回收时就将几管质粒和在一起共40微升进行双酶切。加Buffer 5微升 两种酶各2.5微升。
再答： 你这样做酶切肯定是不合适的，一般来说，小提质粒，3ml菌液，用手工法可以提取5-10ug质粒DNA，试剂盒可以提取10ug左右。手工提取质粒的质量较低，而试剂盒提取的就有明显的质量提高。只用20ul溶解，这样你的质粒浓度就至少达到250ng/ul。如果你做酶切，在20ul酶切体系中，最多只能加入4ul的质粒就可以了，我建议你加入2ul质粒，以保证酶切的效率。另外，你的酶的加量太大，会产生由于甘油浓度过高形成的星星活性，20ul酶切反应体系中，两种酶最多各加1ul。建议你每种加0.3 ul。虽然你使用的pipet调的是0.3，你加的量一定已经超过0.5了，不用担心酶量不足。酶在合适的条件下，其活力足够切大量的DNA，切不开的主要原因是酶切条件不适合，包括酶切用的buffer及DNA中的杂质抑制。参考我回答你的双酶切问题。
再问： 什么是DNA量假如减少呢？是在酶切的时候吗？我质粒是手提的，酶切时加入质粒的量为40微升
再答： 质粒的量并不是以微升算的，它是质量或者摩尔来计算的，质量是ug,mg或者ng，摩尔的单位是mol或者mmol，我们一般说的质粒浓度是指的ng/ul，我说的加量减少，就是降低酶切反应中，质粒DNA的浓度。你说的加入40ul，这是个非常不科学的说法，你的反应体系是多少，质粒浓度是多少，条件非常模糊，这样的问题是没办法解答的，你需要自己清楚这方面的数据。我们一般的酶切体系中的质粒DNA浓度是50ng/ul，给你做个参考。
再问： 谢谢您的回答，我是初学者，就按照实验室以前的套路做，我们在提质粒的最后一步加20微升左右的含有RNase的TE，准备回收时就将几管质粒和在一起共40微升进行双酶切。加Buffer 5微升 两种酶各2.5微升。
再答： 你这样做酶切肯定是不合适的，一般来说，小提质粒，3ml菌液，用手工法可以提取5-10ug质粒DNA，试剂盒可以提取10ug左右。手工提取质粒的质量较低，而试剂盒提取的就有明显的质量提高。只用20ul溶解，这样你的质粒浓度就至少达到250ng/ul。如果你做酶切，在20ul酶切体系中，最多只能加入4ul的质粒就可以了，我建议你加入2ul质粒，以保证酶切的效率。另外，你的酶的加量太大，会产生由于甘油浓度过高形成的星星活性，20ul酶切反应体系中，两种酶最多各加1ul。建议你每种加0.3 ul。虽然你使用的pipet调的是0.3，你加的量一定已经超过0.5了，不用担心酶量不足。酶在合适的条件下，其活力足够切大量的DNA，切不开的主要原因是酶切条件不适合，包括酶切用的buffer及DNA中的杂质抑制。参考我回答你的双酶切问题。