大肠杆菌 乳酸菌如何做实验检测

大肠杆菌 乳酸菌如何做实验检测

大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌.该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能.
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示.
1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃. 1.2 冰箱:0～4℃. 1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃. 1.4 天平. 1.5 显微镜.1.6 均质器或乳钵. 1.7 平皿:直径为90mm. 1.8 试管. 1.9 吸管. 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL. 1.11 玻璃珠:直径约5mm. 1.12 载玻片. 1.13 酒精灯. 1.14 试管架.
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定.
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定.
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定.
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定.
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定.
2.6 生理盐水.
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定.
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液.固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液.
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液.
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管.
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管.
3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管.每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行.
3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验.
3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况.凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.
3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值.
4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性.
4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值
乳酸菌的检测：
一 概述
乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸,需氧和兼性厌氧,多数无动力,过氧化氢酶阴性,革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌.这类细菌在自然界分布广泛,可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内,在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在.乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高,相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用,但个别菌种能对人畜致病,乳酸菌主要包括23个属的细菌.
二 样本采集
检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂,样本应放入冰箱保存,心快检验.
三 检验方法（中华人民共和国国家标准 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB／T 16347-1996）
乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后,所得1ml检样中所含乳酸菌菌落的总数.
（一）检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序如下：
（二）培养基和试剂
改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）；改良MC培养基（modified Chalmers培养基）；0.1％亚甲蓝牛乳培养基；6.5％氯化钠肉汤参照；pH9.6葡萄糖肉汤；40％胆汁肉汤；淀粉水解培养基；精氨酸水解培养基；乳酸杆菌糖发酵管；七叶苷培养基；革兰氏染色液；3％过氧化氢溶液；蛋白胨水、靛基质试剂；明胶培养基；硝酸盐培养基、硝酸盐试剂；生理盐水：定量分装于三角瓶和试管内灭菌.
（三）操作步骤
1．以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml（或25g）放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌广口瓶内做成1：10的均匀稀释液.
2．用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1m,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）.
3．另取1ml灭菌吸管,按上述操作顺序,作10倍增稀释液,如此每递增一次,即换用1支1ml灭菌吸管.
4．选择2～3个以上适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作两个平皿.
5．稀释液移入平皿后,应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15ml,并转动平皿使混合均匀.同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1ml稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照,以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成.
6．待琼脂凝固后,翻转平板,置36℃±1℃温箱内培养72h±3h取出,观察乳酸菌菌特征,选取菌落数在30～300之间的平板进行计数.计算后,随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色,显微镜检查并做过氧氢酶试验.革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性,无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌.根据证实为乳酸菌菌落计算出皿内的乳酸菌数,然后乘其稀释倍数即得每亳升样品中乳酸菌数.例如,检样10－4的稀释液在改良TJA琼脂平板上,生成的可疑菌落为35个,取5个鉴定,证实的乳酸菌的4个,则1ml检样中乳酸菌数为：
35×4／5×104＝2.8×105
7．乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征.
（四）乳酸菌的鉴定
对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时,则作以下试验.
1．菌种制备 自平板上挑取菌落,接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面,于36℃±1℃,24～48h培养,刮取菌苔,分别进行下列试验.
2．乳酸杆菌鉴定试验 极少见还原硝酸盐,不液化明胶,不产生靛基质和硫化氢.
3．常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应.
4．产酸乳的链球菌的鉴别试验.