植物细胞杂交与组织培养相似之处的步骤

植物细胞杂交与组织培养相似之处的步骤

植物体细胞杂交过程：
将植物细胞A与植物细胞B用纤维素酶和果胶酶处理,得到不含细胞壁的原生质体A和原生质体B,运用物理方法或是化学方法诱导融合,形成杂种细胞,再利用植物细胞培养技术将杂种细胞培养成杂种植物体.
①杂交时间：植物细胞杂交是从细胞融合开始,到培育成的新植物体结束.
a.原生质体制备：用酶解法去除细胞壁（纤维素酶和果胶酶）
b.原生质体融合：膜融合（高钙、高pH诱导融合）、核融合（杂种细胞第一次有丝分裂时融合）
原生质体的融合
一、融合方法
1．PEG诱导融合法
 PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低,勿需特殊设备；融合子产生的异核率较
高；融合过程不受物种限制.其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害.
 PEG的作用机理： Kao等认为,由于PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极
性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在在原生质体之间形成分子桥,其
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授
结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外,PEG能增加类脂膜的流动
性,也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能.
 融合技术要点：
融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmol
KH2PO4 0.7mmol
甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol
pH 5.6
诱导液：融合液＋PEG 20～45％
稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5
葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375
CaCl2·2H2O 0.79 NaOH 0.169
DMSO 10ml
2．电融合法
 与PEG融合比较起来,电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便.
电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分.
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通过原生
质体而不是通过溶液,其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体
紧密接触排列成串；
P1 P2
P1 P2
混合静止1min.
融 合
融合液
加入PEG
稀 释洗 涤
加入稀释液
加入培养基
培 养
选 择
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授
膜的击穿：原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,从而
导致两个紧密接触的细胞融合在一起.
 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的
处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等.
影响原生质体融合的因素
首先,原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用,高质量的原生质体是细胞融合
的首要条件.
其次,融合方法
其三是融合参数,包括各种融合液都应选择适当.
c.方法：物理方法（离心、振动、电激）、化学方法（聚乙二醇（PEG））
d.杂种细胞的筛选和培养：机械法、生理法、遗传法
e.杂种细胞的再生和鉴定：由愈伤组织再培养出杂种植株的过程
杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定
一、杂种细胞的发育动态
核质重组
细胞器重组
部分核物质或细胞器丢失
核分裂的非同步性
二、体细胞杂种的特点
形态上的趋中性
变异幅度大
非整倍性
双亲性状的共显性
偏亲现象
三、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定
1．杂种细胞的选择系统
外观选择
 互补选择
 荧光标记选择
2．体细胞杂种的鉴定
 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定.
 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定.
 生化鉴定：同功酶鉴定.
 分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定.
体细胞杂种的遗传特性
1．细胞分裂与染色体丢失
如果细胞分裂而核不发生融合,在以后的发育过程中就会有两种结果,一是细胞分裂
几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失.
如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因.
2．基因转移与性状表达
由于染色体的部分丢失,常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生
整合,其结果是实现了亲本间的基因转移.基因转移通常是在后代中某些性状得以表达,有
时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状.
3．体细胞杂种遗传上的不稳定性
体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定,这可能涉及到多方面的因素,如亲缘关系的远
近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等.
②优点：克服远缘杂交不亲和的障碍,扩大杂交亲本范围,培育新优良品种.
③举例：“白菜-甘蓝”同白菜相比,具有生长期短,耐热性强,和易储藏等优点.
植物组织培养步骤
第一步,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗.把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜.置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜.易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗.流水冲洗在污染严重时特别有用.洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水.洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触.当然,最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温.
第二步是对材料的表面浸润灭菌.要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等.用70%酒精浸10～30秒.由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长.有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间.处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料.
第三步是用灭菌剂处理.表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1—2种使用见表.第四步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-l0次左右.无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强,幼嫩材料易在酒精中失绿,所以浸泡时间要短,防止酒精杀死植物细胞.②老熟材料,特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些,如种子可以浸泡5分钟.③升汞的渗透力弱,一般浸泡10分钟左右,对植物材料的杀伤力不大.④漂白粉容易导致植物材料失绿,所以对于幼嫩材料要慎用.⑤在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80（一种湿润剂）,可以降低植物材料表面的张力,达到更好的消毒效果.
其实,植物的体细胞杂交之后植物的生长还是会依赖于植物的组织培养过程的.因为植物体细胞杂交的技术实现上还是有困难,一般没有提到体细胞杂交之后的后续工作了.