在紫外光照射下,蛋白质会不会变性,会不会影响紫外分光光度法测定蛋白质含量?

来源：学生作业帮编辑：神马作文网作业帮分类：生物作业时间：2024/09/29 22:24:08

主要是让蛋白质变性,使之失去生物活性.具体的过程主要是蛋白质分子中的一些化学键比较不稳定.用紫外分光光度法测蛋白质含量：四种紫外吸收法:
1.280nm的光吸收法
用标准曲线法进行测定.标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL.常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA).
标准曲线的测定：
取6支试管,按下表编号并加入BSA(1.0 mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,用蒸馏水补体积至5.0 mL；测定A280 ：用第1管为空白对照,各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280,以A280为纵坐标,各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横坐标作图,标准曲线应为直线.
利用此标准曲线,根据测出的未知样品的A280值,即可查出未知样品的蛋白质含量.
2.280 nm和260 nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收,在280 nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克),但核酸在260 nm处的吸收更强,其吸收高峰在260 nm附近.核酸260 nm处的消光系数是280 nm处的2倍；而蛋白质则相反,其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值.通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ＝1.8
纯核酸的光吸收比值：A280/A260＝ 0.5
含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其A280和A260,由此吸收差值,用下面的经验公式,即可算出蛋白质的浓度.
蛋白质浓度=1.45×A280 － 0.74×A260 (mg/mL)
3.215 nm与225 nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收测定时,可用215nm与225 nm吸收值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度.
用已知浓度的标准蛋白质,配制成20～100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白质溶液,分别测定215 nm和225 nm的吸光度值,并计算出吸收差:
吸收差D= A215 － A225
以吸收差D为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘出标准曲线.再测出未知样品的吸收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度.
4.肽键测定法
蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比.因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液,测定238 nm的光吸收值A238,以A238为纵坐标,蛋白质含量为横坐标,绘制出标准曲线.未知样品的浓度即可由标准曲线求得.

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