如何筛选鼠伤寒沙门氏菌的组胺酸缺陷型菌株及其应用举例

如何筛选鼠伤寒沙门氏菌的组胺酸缺陷型菌株及其应用举例

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株,在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落.受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落.某些化学物质需经代谢活化才有致变作用,在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶①,可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足.鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关,故此法现广泛应用于致癌物的筛选.
编辑本段步骤和方法
　　Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验.　　1．菌株鉴定 用于测试的菌株,需经基因型和生物学性状鉴定,符合要求才能投入使用.　　目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102.鉴定前先进行增菌培养.为鉴定结果可靠,需同时培养野生型TV菌株,作为测试菌基因型之对照.增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基,接种后于37℃,100r／min振荡培养12h左右,细菌生长相为对数期末,含菌数应为1×109个／ml～2×109个／ml.　　鉴定项目：　　（1）脂多糖屏障丢失（rfa）用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液,在营养琼脂平板上分别划平行线,然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条,浸湿结晶紫溶液,贴放在平板上与各接种平行线垂直相交.盖好皿盖后倒置于37t温箱,培养24h后观察结果.　　（2）R因子 划线接种,贴放滤纸条及培养等均同上,唯滤纸条浸湿的药液不同,为氨苄青霉素钠溶液.TA102除pKM101外,还有pAQ1,载有抗四环素的基因,故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上.　　（3）紫外线损伤修复缺陷（△uvrB）在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后,一半接种线用黑玻璃遮盖,另一半暴露于紫外光下8sec,然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿,防止可见光修复作用.培养同上.　　（4）自发回变 预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平.平皿倒置于37℃温箱培养48h.　　（5）回变特性——诊断性试验 上层软琼脂中除菌液外,还注入已知阳性物之溶液,需活化系统者并加入S9mix,余同上.　　组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知.　　2．斑点试验 吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml,注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中,需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix,立即混匀,倾于底平板上,铺平冷凝.用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘,纸片浸湿受试物溶液,或直接取固态受试物,贴放于上层培养基的表面.同时做溶剂对照和阳性对照,分别贴放于平板上相应位置.平皿倒置于37℃温箱培养48h.在纸片外围长出密集菌落圈,为阳性；菌落散布,密度与自发回变相似,为阴性.　　3．平板掺入试验 将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中,需代谢活化的再加0.3ml－0.4ml S9mix,混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝.同时做阴性和阳性对照,每种处理做3个平行.试样通常设4个～5个剂量.选择剂量范围开始应大些,有阳性或可疑阳性结果时,再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系.培养同上.同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比,为致变比（MR）.MR值≥2,且有剂量-反应关系,背景正常,则判为致突变阳性.