神马作文网real time pcr 结果中spectra是什么意思?我的目标基因表达量太低了 原液跑都在33个循环后起峰,怎么办
来源：学生作业帮 编辑：神马作文网作业帮 分类：物理作业 时间：2024/11/23 21:09:13
real time pcr 结果中spectra是什么意思?我的目标基因表达量太低了 原液跑都在33个循环后起峰,怎么办?
光谱,使用不同的荧光染料或者分子探针有不同的光谱.这要根据自己使用情况选择.理论上只要有一条模板,应该都不至于吧?是不是引物设计不好?建议重新设计几对引物再做.
再问： 我设计了好几对引物，这对应该没问题的吧。在ORF里面，大小也在150~200bp范围，没有二聚体出现，普通PCR跑EB胶之前检测过，有单一条带。
再答： 普通pcr跑出来有一条条带，不代表起产物就一定是单一的，最好是定量反应完之后做溶解曲线。引物也不一定非要设置在orf区内，有时候为了保证特异性，常常使用5‘端非编码区来设计引物，另外引物最好跨内含子设计，产物大小在70-200之间。产物小点更好。
再问： 溶解曲线我做了，都是单一的峰，峰值在温度80以上。就是基因丰度太低了，反转录1ug的cDNA原液取1ul加到20ul体系里做模板，起峰还在33个循环后
再答： 没有遇到过这种情况，会不会逆转录rna浓度太高了导致逆转录不完全，效果不理想。至少我没有遇到过这种情况，一般都是在20-30之间。
再问： 我最近也被这个愁死了
再答： 建议校正一下仪器。是不是长时间没有校正仪器了。
再问： 我设计了好几对引物，这对应该没问题的吧。在ORF里面，大小也在150~200bp范围，没有二聚体出现，普通PCR跑EB胶之前检测过，有单一条带。
再答： 普通pcr跑出来有一条条带，不代表起产物就一定是单一的，最好是定量反应完之后做溶解曲线。引物也不一定非要设置在orf区内，有时候为了保证特异性，常常使用5‘端非编码区来设计引物，另外引物最好跨内含子设计，产物大小在70-200之间。产物小点更好。
再问： 溶解曲线我做了，都是单一的峰，峰值在温度80以上。就是基因丰度太低了，反转录1ug的cDNA原液取1ul加到20ul体系里做模板，起峰还在33个循环后
再答： 没有遇到过这种情况，会不会逆转录rna浓度太高了导致逆转录不完全，效果不理想。至少我没有遇到过这种情况，一般都是在20-30之间。
再问： 我最近也被这个愁死了
再答： 建议校正一下仪器。是不是长时间没有校正仪器了。
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