神马作文网巢式PCR扩增阴性对照有非特异性扩增
来源：学生作业帮 编辑：神马作文网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/18 00:50:54
巢式PCR扩增阴性对照有非特异性扩增
第一泳道：第一轮扩增的阳性对照、 第二泳道：阴性对照
第三泳道：marker、 第四、五泳道：第二轮扩增的阳性对照
第六泳道：用第一轮扩增的阴性对照产物做的模板,按理说不应该有那个100bp的抹带.如果是非特那4、5泳道却没有.引物二聚体也不应该有100bp大吧~
这个是什么,应该怎么消除
第一泳道：第一轮扩增的阳性对照、 第二泳道：阴性对照
第三泳道：marker、 第四、五泳道：第二轮扩增的阳性对照
第六泳道：用第一轮扩增的阴性对照产物做的模板,按理说不应该有那个100bp的抹带.如果是非特那4、5泳道却没有.引物二聚体也不应该有100bp大吧~
这个是什么,应该怎么消除
应该是引物的延伸性dimer,看弥散程度不像是条带,你可能要看下你第一轮和第二轮引物之间会不会有extensible primer-dimer,毕竟你用的阴性对照产物做模板,里面虽然没有DNA,但是有你第一轮扩增的引物.而你第一轮后阴性对照里的引物浓度肯定高于阳性对照,所以阳性对照没有这个条带也可以这样解释.
如果想消除的话可以提高一下退火温度,或者换一个热启动的酶,要不就换下引物.
不知道你试验要做什么,如果是回收测序的话,这样的条带又不在目标附近,反正要胶回收的,不用变什么也没问题.
我是这么认为的.
再问： 你好，谢谢你的讲解分析。我是做检测的，我想可不可以将第一轮的阴性对照产物稀释10倍做？（这样做对于检测结果还可信吗？有说服力吗？）因为我的第5泳道就是稀释第一轮产物后扩的，没有500多的那个片段，而第4泳道没有稀释就有。
再答： 检测？检测有没有特定基因吗，巢式PCR本来就容易有非特异扩增，我觉得你增加稀释倍数不如降低反应数，你现在前后两轮都扩增多少个cycle？而且既然是做检测，你也就不要求反应效率了，为什么不先调高退火温度呢？
再问： 没有特定基因。就是能鉴定样品就行，我现在的第一轮：25cycles；第二轮：30cycles 我现在两轮的退火温度都是61度。现在如果减少循环数、提高退火温度的话，灵敏度降低的多不多呢？
再答： 减少cycle和你稀释样品是一个道理。提高退火温度最好，提高退火温度是提升扩增的特异性，但是肯定降低扩增效率，就是条带会变暗，但是杂带会少。你说的灵敏度的概念我不是太理解。不过总的来说还是建议你先提高温度。
再问： 你好,我说的灵敏度是指我做的巢式PCR的检测线是多少,也就是说在样本中我的目的片断的可以检测到的最低含量~~~我就是怕这个因为退伙温度的提高,灵敏度降低了....所以还是请问有什么其他办法,在不降低或少降低灵敏度的情况下减少或去除那个阴性的抹带吗？
再答： 那只能一个是换引物，另一个是换酶了。如果方便的话我觉得换酶最好，你换一个热启动（hot start）的酶，基本就很难出这些非特异性条带了。
再问： 恩,好的,那如果换了热启动酶,反映的温度条件需要改变吗?给我推荐个公司吧~谢谢！
再答： 我一般换用hotstart的酶会把退火温度再提高1到2度，我们实验室用的我记得是QIAGEN的，效果很好，不过好像挺贵的。
如果想消除的话可以提高一下退火温度,或者换一个热启动的酶,要不就换下引物.
不知道你试验要做什么,如果是回收测序的话,这样的条带又不在目标附近,反正要胶回收的,不用变什么也没问题.
我是这么认为的.
再问： 你好，谢谢你的讲解分析。我是做检测的，我想可不可以将第一轮的阴性对照产物稀释10倍做？（这样做对于检测结果还可信吗？有说服力吗？）因为我的第5泳道就是稀释第一轮产物后扩的，没有500多的那个片段，而第4泳道没有稀释就有。
再答： 检测？检测有没有特定基因吗，巢式PCR本来就容易有非特异扩增，我觉得你增加稀释倍数不如降低反应数，你现在前后两轮都扩增多少个cycle？而且既然是做检测，你也就不要求反应效率了，为什么不先调高退火温度呢？
再问： 没有特定基因。就是能鉴定样品就行，我现在的第一轮：25cycles；第二轮：30cycles 我现在两轮的退火温度都是61度。现在如果减少循环数、提高退火温度的话，灵敏度降低的多不多呢？
再答： 减少cycle和你稀释样品是一个道理。提高退火温度最好，提高退火温度是提升扩增的特异性，但是肯定降低扩增效率，就是条带会变暗，但是杂带会少。你说的灵敏度的概念我不是太理解。不过总的来说还是建议你先提高温度。
再问： 你好,我说的灵敏度是指我做的巢式PCR的检测线是多少,也就是说在样本中我的目的片断的可以检测到的最低含量~~~我就是怕这个因为退伙温度的提高,灵敏度降低了....所以还是请问有什么其他办法,在不降低或少降低灵敏度的情况下减少或去除那个阴性的抹带吗？
再答： 那只能一个是换引物，另一个是换酶了。如果方便的话我觉得换酶最好，你换一个热启动（hot start）的酶，基本就很难出这些非特异性条带了。
再问： 恩,好的,那如果换了热启动酶,反映的温度条件需要改变吗?给我推荐个公司吧~谢谢！
再答： 我一般换用hotstart的酶会把退火温度再提高1到2度，我们实验室用的我记得是QIAGEN的，效果很好，不过好像挺贵的。